蛋白質(zhì)表達、分離、純化步驟

　　蛋白質(zhì)表達、分離、純化可以：
 

　　(1)探索和研究基因的功能以及基因表達調(diào)控的機理；
 

　　(2)供作結(jié)構(gòu)與功能的研究；
 

　　(3)作為催化劑、營養(yǎng)劑等。
 

　　實驗步驟：
 

　　一：材料準備
 

　　1. 實驗材料：大腸桿菌 BL21、LB 液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸餾水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉
 

　　2. 實驗儀器：搖床、離心機、層析柱、離心管、移液槍、槍頭盒、燒杯、玻璃棒
 

　　二：實驗操作
 

　　1. 試劑準備
 

　　2. 獲得目的基因
 

　?、?PCR 方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點)，PCR 循環(huán)獲得所需基因片段。
 

　　② 通過 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法從細胞或組織中提取總 RNA，以 mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成 cDNA 第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行 PCR 循環(huán)獲得產(chǎn)物。
 

　　3. 構(gòu)建重組表達載體
 

　?、?載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收 Kit 或凍融法回收載體大片段。
 

　　② PCR 產(chǎn)物雙酶切后回收，在 T4DNA 連接酶作用下連接入載體。
 

　　4. 獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種
 

　?、?將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，根據(jù)重組載體的標志(抗 Amp 或藍白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
 

　　② 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確， 進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
 

　?、?以此重組質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。
 

　　5. 氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導
 

　?、?接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液體培養(yǎng)基中(含 100 ug/mL 氨芐青霉素)，37 ℃ 震蕩培養(yǎng)過夜。
 

　　② 按 1∶50 或 1：100 的比例稀釋過夜菌，一般轉(zhuǎn)接 1 mL 過夜培養(yǎng)物于 100 mL(含 100 ug/mL 氨芐青霉素)LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 震蕩培養(yǎng)至 OD600 = 0.6 - 0.8(最好 0.6，大約需 3 h)。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　③ 對照組不加誘導劑，實驗組加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l，37℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 1-3 h。
 

　?、?12 000 rpm 離心 10 min，棄上清，菌體沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
 

　　6. 氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
 

　　① NTA 層析柱的準備：在層析柱中加入 1 mL NTA 介質(zhì)，并分別用 8 mL 去離子水，8 mL 上樣緩沖液洗滌。
 

　?、?重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入 5 mL 上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　?、?上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　④ 洗脫雜蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脫液，約 3-4 h，取 10 ul 洗脫開始時的樣品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　⑤ 洗脫目標蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 級分，分別取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。