DNA建庫中PCR擴(kuò)增子建庫方法應(yīng)用相對(duì)較少的原因
更新時(shí)間：2021-08-30 點(diǎn)擊次數(shù)：2147
DNA建庫方法是分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理，其本質(zhì)就是在待測片段兩端加上接頭的過程。目前DNA建庫方法按照接頭連接方式不同可分為五類：TA克隆連接接頭建庫、Swift法建庫、轉(zhuǎn)座酶法建庫、PCR擴(kuò)增子建庫、平末端連接接頭建庫。 其中平末端連接接頭的方法基于Ion Torrent平臺(tái)。與Illumina平臺(tái)類似，Ion Torrent平臺(tái)的文庫構(gòu)建目的也是在片段化好的DNA片段兩端加上特定接頭，該方法一般包括4個(gè)步驟：DNA樣本片段化、末端修復(fù)，連接adapter（PI和A/P1和X），選擇性回收DNA片段，文庫PCR富集，純化PCR產(chǎn)物。
需要注意的是：在Ion Torrent平臺(tái)構(gòu)建好的文庫通過油包水PCR種到測序柱子上，文庫中的X或A接頭是測序起始端，而P1接頭是是連到測序珠子的這一端。與Illumina通過采集熒光信號(hào)記錄記錄堿基序列的方法不同，Ion Torrent的測序是通過微環(huán)境中pH值短暫的下降被pH電極檢測到并且把測得的值傳給計(jì)算機(jī)記錄。
綜上，NGS建庫可以按照接頭加入目的片段的不同分為5種，其中TA克隆連接接頭建庫法應(yīng)用*泛，適用于絕大多數(shù)樣本建庫，是目前商業(yè)化建庫方式的主流；Swift法與TA克隆連接接頭法類似，操作上相對(duì)繁瑣，P5接頭和P7接頭是分兩步連接上的；
轉(zhuǎn)座酶法只需1h 40min即可完成文庫構(gòu)建，可以節(jié)省大量的人力，但是在應(yīng)用上只適用于cDNA和全基因組等文庫的構(gòu)建，且轉(zhuǎn)座酶本身具有偏好性，對(duì)后續(xù)的測序質(zhì)量會(huì)有一定的影響；
PCR擴(kuò)增子建庫是捕獲建庫的一種，適用于臨床背景下靶向基因的研究，平末端連接接頭建庫適用于Ion Torrent平臺(tái)，Ion Torrent*相對(duì)較低，所以此建庫方法應(yīng)用范圍相對(duì)較少。
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